表觀遺傳之基因組印記

說起基因組印記(Genomic imprinting),小編的記憶還停留在上學幫師兄查印記基因(imprinted genes)數據庫的時候。那個時候其實根本不懂印記到底是什么,只記住了師兄在耳邊的碎碎念“父本印記則母本表達父本甲基化,母本印記則父本表達母本甲基化”。雖然后來做印記方面的工作少了,但是提起基因組印記還是倍感親切(也可能是對當年徹夜的查數據庫的耿耿于懷)。

今年2月份發表在核酸研究上的一篇工作就采用了10X左右的Nanopore測序的數據進行基因印記的相關研究。作者采用兩種方法(Basecall method基于Fastq數據,Signal method基于原始電信號)對Nanopore測序的read進行單倍型分配,并識別父母本等位差異的甲基化區域。這些等位差異的甲基化區域中有部分是已知的印記控制區,同時結果與RNA-seq等位特異表達和RRBS數據結果吻合。因此作者認為那些新的等位差異甲基化區域可能是新的印記控制區。

關鍵結論

1. Nanopore測序得到的樣品的甲基化水平與RRBS結果一致性很高
2. Nanopore read比RRBS數據更容易進行單倍型分配,且85.7%的read能夠被正確分配
3. 不同單倍型間識別到的差異甲基化區域可能是候選的印記控制區
其實小編還想碎碎念一句,其實Nanopore數據不是只能做CpG,還能做5mC,6mA啦!分析完甲基化還能再分析分析結構變異呀~ 這么一套牛哄哄的數據只用來分析CpG還是太可惜啦!

當當當,詳細解讀來啦~~

文章:Using long-read sequencing to detect imprinted DNA?methylation

發表日期:2019年2月

雜志:Nucleic Acids Research

影響因子:11.561

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研究背景

基因印記作為一個經典的表觀遺傳現象,是指基因的表達具有親本選擇的現象,即只一個親本的等位基因表達,另一個親本的等位基因不表達或很少表達。印記基因在生長發育中。眾多假設認為DNA甲基化是基因組印記的主要機制,即許多的基因印記是由不同親本來源的等位基因調控區的差異甲基化造成的。

研究方法

  • RRBS:?B6 X Cast
  • RNA-seq:4個B6 X Cast正反交子代,4個Cast X B6正反交子代
  • Nanopore:B6 X Cast, Cast X B6

研究結果

  • ?Nanopore甲基化結果與其他技術結果一致

對B6 X Cast雜交的F1子代的雄性胚胎(E14.5)采用MinION平臺進行8X深度的測序,采用Nanopolish軟件識別甲基化。轉錄起始位點處甲基化水平降低,且如先前報道一致,胎盤組織的全基因組甲基化水平在50%左右。采用RRBS對相同樣品進行測序發現了兩個技術平臺的甲基化水平相似。

  • Nanopore測序的read單倍型有效率更高

作者定義了兩種分配單倍型的方法(Basecall method基于Fastq數據,Signal method基于原始電信號)。作者將測序數據與SNP標記的基因組進行比對,如果read上有至少5個高置信的SNP則將單倍型分配給Nanopore read,對于RRBS數據,只要有一個SNP即分配單倍型。結果發現只有24%的RRBS測序read被分配了單倍型,而74%的Nanopore測序的read可以被分配單倍型,且父母本等位各一半。同時對于雄性樣品,比對到X染色體上絕大多數91%的read都被分配為母本單倍型。

為了進一步評估nanopore測序read分配單倍型的準確性,作者又測了B6自交和Cast自交的組織。用相同的單倍型分配步驟,85.7%的read可以正確分配到相關的基因型,而只有1.5%是錯配的。

  • 親本特異和品系特異的基因表達

對B6和Cast正反交和自交的F1的胎盤組織分別進行RNA-seq測序。結果發現135個基因具有親本特異表達,其中88個是母本等位高表達47個是父本等位高表達。而這135個基因中,有53個是已知的印記基因,這其中又有17個(包含Fkbp6, Smoc1/2, Gzmc/d/e/f/g, Zdhhc14 and Arid1b)在近期的研究中被認為是印記的。剩下的65個基因則組成了小鼠胎盤中候選的親本偏好表達基因。

  • Nanopore測序觀測到的已知的印記控制區

作者結合nanopore read的單倍型和甲基化數據來比較親本等位間的甲基化。發現Nanopore測序的數據非常容易觀測出已知的印記控制區的DMR,且與RNA-seq和RRBS的等位特異情況一致。作者發現Nanopore的數據涵蓋了大多數已知的印記控制區的差異甲基化,而這種甲基化差異往往會延伸到印記控制區外。

作者接下來嘗試去發現親本等位間的差異甲基化區域(DMR)以及品系特異的DMR。作者共得到933個DMR,其中309個可以被親本的差異所解釋,其余則是源自品系的差異。結合RRBS單倍型和RNA-seq的數據進一步證明了差異甲基化和差異表達,進而找到印記基因上感興趣的DMRs。排名靠前的前20個DMRs中有15個對應于已知的印記控制區。雖然很多排名靠后的DMR可能是假陽性的,但是這些DMR依然包含了已知區域的印記表達。

  • 差異甲基化分析上長read的優勢

最后,作者通過幾個例子闡述了相比于傳統的重亞硫酸鹽測序,基于nanopore的方法在識別親本等位DMR上的諸多優勢。這里,小編就不贅述啦。

參考文獻

Gigante?S, Gouil Q, Lucattini A, et al.Using long-read sequencing to detect imprinted DNA?methylation.?Nucleic Acids Research.?2019.02

 

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